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bradford法测蛋白浓度原理,测定蛋白质含量的方法有哪些，其原理各是什么

admin admin 发表于2024-01-09 14:37:19 浏览12 评论0

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请教Bradford法测定蛋白浓度原理及方法

解：是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。试剂和仪器一、
试剂试剂盒自备：G250
染色液、BSA标准蛋白。BSA标准蛋白浓度已稀释至500μg/ml，-20℃保存。二、
测试样品待测样品蛋白浓度稀释在50-500μg/ml范围内为宜。三、仪器96孔酶标、酶标仪。操作方法标准品编号12345678500ug/mlBSA/μl01.53612182430蒸馏水/μl3028.52724181260
分别于小离心管中混匀后，取20μl加入到对应酶标孔中待测样品编号9101112131415……待测样品稀释后，各取20μl加入到相应酶标孔中G250/μl200
μl/孔反应3-5min1.
用酶标仪测定A595nm处的吸光值。2.
根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。

bradford法测定蛋白质的原理是什么？

bradford法测定蛋白质含量，也就是考马斯亮蓝法，其原理是考马斯亮蓝在游离状态下呈棕红色，最大光吸收在488nm; 当它与蛋白质结合后变为蓝色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。不利因素主要是特殊蛋白的结构，缓冲液组分中有干扰试剂等。
扩展资料：
考马斯亮蓝法该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
参考资料来源：
百度百科-考马斯亮蓝法

测定蛋白质含量的方法有哪些,其原理各是什么.

Bradford法测定蛋白质浓度
（一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋
白质溶液测定的方法.
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法）,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白
质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定
法.
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置（?max）,由465nm变为595n
m,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.
在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比.
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1?g.这是因为蛋白质与染料结合后产生
的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的
多.
（2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的
大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间.
（3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不
干扰此测定法.

bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响

采用Bradford法，即考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。原理是考马斯亮蓝在电离状态下呈现棕红色，最大吸光量为488nm。当与蛋白质结合时，它变成蓝色，并且蛋白质与色素结合时在波长595nm处吸收光最大。其吸光值与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质的定量测定。
蛋白与考马斯亮蓝在2min左右达到平衡，反应非常迅速。粘结剂在室温下保持稳定1h。该方法制备的试剂简单，操作方便，反应灵敏度高。灵敏度比Lowry法高4倍，可测定微克水平的蛋白质含量。主要的不利因素是特殊蛋白的结构和缓冲液中的干扰剂。
扩展资料：
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：
1、Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2、标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3、将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4、按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5、每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
6、根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
参考资料来源：百度百科-考马斯亮蓝法

测定蛋白质含量的方法有哪些，其原理各是什么

1、凯氏定氮法
凯氏定氮法是由丹麦化学家凯道尔于1833年建立的，现已发展为常量、微量、平微量凯氏定氮法以及自动定氮仪法等，是分析有机化合物含氮量的常用方法。
凯氏定氮法的理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16%左右，因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即: 蛋白质含量=含氮量/16%。
2、紫外吸收光谱法
紫外吸收光谱法又称紫外分光光度法，是根据物质对不同波长的紫外线吸收程度不同而对物质组成进行分析的方法。此法所用仪器为紫外吸收分光光度计或紫外-可见吸收分光光度计。
光源发出的紫外光经光栅或棱镜分光后，分别通过样品溶液及参比溶液，再投射到光电倍增管上，经光电转换并放大后，由绘制的紫外吸收光谱可对物质进行定性分析。
扩展资料：
蛋白质含量测定的意义：
饮食蛋白质符合人的需要时，就能维持正常代谢，产生抗体，抵抗感染，有病也轻易恢复。相反，当蛋白质供应不足时，就会出现体重下降、贫血和传染病。伤口和骨折不易愈合;在严重缺乏，血浆蛋白减少和水肿可能发生。
低蛋白质摄入和癌症之间也有联系。但是过多的蛋白质也会对肾脏造成压力。过量积聚的尿酸、氨和酮体所产生的食物蛋白代谢在体内可导致衰老;氨对身体也是有毒的，它不仅会突然增加肝脏的负担，还会增加胃肠道的负荷，导致肝、肾受累和消化不良。因此，蛋白质的摄入量应该是适当的。
参考资料：百度百科-紫外吸收光谱法
参考资料：百度百科-凯氏定氮法
参考资料：百度百科-蛋白质含量
①凯氏定氮法 原理：蛋白质平均含氮量为16%。
当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
Bradford法测定bai蛋白质浓度：实验原理。
双缩脲法（duBiuret法）和zhiFolin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制dao,促使科学家们去寻找更好的蛋。
取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致。
将液体混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。
扩展资料：
紫外吸收法：
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。
取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。
参考资料来源：百度百科-蛋白质测定

BCA蛋白定量和 Bradford法蛋白定量有哪些区别

一、原理不同
BCA蛋白定量：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，吸光强度与蛋白浓度成正比。测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
Bradford法蛋白定量：在一定的浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
二、样品中物质含量不同
BCA蛋白定量：样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20、60、80。
Bradford法蛋白定量：样品中SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。
扩展资料
BCA蛋白定量的注意事项：
1、BCA蛋白定量时，吸光度可随时间的延长不断加深，且显色反应会随温度升高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育or延长孵育时间。
2、标准蛋白液的加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来的标准曲线出现偏差，影响待测样品的浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置标准蛋白液，另一方面应使用精确度高的移液枪。
3、为加快BCA蛋白定量测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但切勿过热。
4、当结果出现空白组本身就有较高的背景，可用Bradford法蛋白定量重新测定蛋白浓度。
参考资料来源:百度百科-蛋白定量

测定蛋白质含量的方法及原理

测定蛋白质含量的方法有多种，常用的包括比色法、光谱法和生物学法。以下是对这一问题的详细描述：
1.比色法尺度法
比色法是测定蛋白质含量最常用的方法之一。原理是利用蛋白质与染色剂反应生成复合物，进而通过比色反应来测定蛋白质浓度。例如，布拉德福酸染色法Bradfordmethod和比二巴氏法BicinchoninicAcidmethod都是常用的比色法。
2.光谱法
光谱法是根据蛋白质分子特定的吸收光谱来测定其浓度的方法。例如，紫外吸收光谱法可利用蛋白质中芳香族氨基酸如酪氨酸和色氨酸对紫外光的吸收来进行测定。
3.生物学法
生物学法主要是利用蛋白质与其他生物分子的特定相互作用来进行测定。常用的方法包括低瑞金氏法Lowrymethod、BCA法BicinchoninicAcidmethod和布莱特林法Biuretmethod。这些方法基于蛋白质与某些试剂如草酰胺的反应，产生比色反应来测定蛋白质的含量。
4.原理与应用
这些测定方法的原理都是基于蛋白质与特定物质的相互作用，通过测定产生的色素的吸光度或比色反应，来间接测定蛋白质的含量。这些方法灵敏度高、操作简单、结果准确，被广泛应用于生物化学、医药、食品科学等领域。
5.注意事项
在进行蛋白质含量测定时，需要注意样品的处理和稀释，避免可能干扰测定结果的因素。同时，在选择测定方法时，要根据实验目的和需要选择适当的方法，以确保测定结果的准确性和可靠性。
总结：
测定蛋白质含量的方法包括比色法、光谱法和生物学法。比色法利用蛋白质与染色剂生成复合物进行比色反应；光谱法基于蛋白质分子的吸收光谱来测定蛋白质浓度；生物学法利用蛋白质与其他生物分子的特定相互作用实现测定。
这些方法在科研、医药和食品等领域得到广泛应用，具有操作简单、结果准确的优点。在进行测定时，需要注意样品处理和稀释，并根据实验目的选择适当的方法来保证结果的准确性。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量原理


考马斯亮蓝法测蛋白质含量原理
在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465 nm 变为595 nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。
将蛋白质样品或稀释的BSA 与Bradford试剂混合，测量在595 nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

Bradford法是怎末一回事？

考马斯亮兰法~一种蛋白定量法~
具体操作步骤:（一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）试管16支
（三）操作方法
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
我们都经常用到~~