本文目录一览：
- 1、16.Nanopore测序
- 2、英媒称英国发现一种新的猴痘毒株，有哪些信息值得注意？
- 3、基因测序是什么市场结构类型
- 4、三份猴痘病毒最新基因测序结果公布，其中哪些信息值得关注？
- 5、生信分析 Minimap2+sniffles calling SVs
- 6、DNA测序可以采用哪些手段，并阐述各自的原理
16.Nanopore测序
Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术都不同，它是基于 电信号 而不是光信号的测序技术，该技术的关键之一是：他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。
在自然界中，有一种可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后的reader蛋白被嵌入到高电阻率的 Membrane （人工合成的多聚物膜），膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。在 Nanopore 文库构建时，需要在接头上连接一种用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中的motor蛋白。当构建好的文库流经Nanopore测序芯片的时候，芯片上的tether蛋白锚定DNA或RNA链，防止在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。此时解开的其中一条链会穿过蛋白质孔，它在通过蛋白孔时，会对膜两边离子的稳定流动产生扰动。不同的碱基，对离子流的影响不同，也就会产生不同的电流大小，进而产生电流信号，灵敏的电子设备检测到这些变化经过计算机软件识别后，推断出碱基类型，完成测序。纳米孔测序（和其他第三代测序技术）有望解决目前测序平台的不足。
纳米孔测序的主要特点是： 读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb；错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端；数据可实时读取;通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成)；起始DNA在测序过程中不被破坏；以及样品制备简单又便宜 。理论上，它也能直接测序RNA。纳米孔单分子测序计算还有另一大特点， 它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶 ，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助，并且改方法的测序准确性可达99.8%，而且一旦发现测序错误也能较容易地进行纠正。
英媒称英国发现一种新的猴痘毒株，有哪些信息值得注意？
猴痘是一种常见于非洲中部和西部部分地区的罕见感染，可通过人类旅行传播到其他地区。
现在在欧洲、英国和美国都有确诊和疑似病例，专家们还不知道病毒是如何、在哪里以及在社区中传播了多长时间。
该病毒不易在人与人之间传播，而是通过与受感染的动物、人或毛巾和床上用品等污染物的密切接触传播。 此外，接触飞沫、体液或猴痘可引起传播。
猴痘的早期症状包括发烧、肌肉疼痛、头痛、寒战、疲劳和淋巴结肿大，许多人在发烧后 1 至 5 天内出现皮疹。
皮疹可能看起来像水痘或梅毒，它会发生变化并经历不同的变化阶段，最终结痂并脱落。 一个人具有传染性，直到所有结痂脱落并且结痂下有完整的皮肤，尽管结痂本身也可能含有传染性物质。
这种疾病的症状通常是轻微的，并在一个月内自行消失。 世界卫生组织表示，儿童患这种疾病的风险高于成人，但它可能导致怀孕期间出现并发症，包括死产和先天性猴痘，死亡率可达 1% 至 10%。
团队用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)从患者皮肤渗出样品中提取出猴痘病毒的DNA，使用快速条形码测序试剂盒(SQK-RBK004)，在Oxford Nanopore MinION平台上对病毒基因组进行了鸟枪法宏基因组测序。
这个阶段，从新冠到猴痘，再到阿根廷的军团病，印度的未知病毒，全部上线激活
据多家英国媒体2日报道，英国卫生官员称，在一名被确诊感染猴痘病毒的英国患者身上发现了一种新的猴痘毒株。英国卫生安全局(UKHSA)表示，此人最近去过西非，并住院接受治疗。感染原因不明。报道称，经过病毒检测，发现这名患者的感染毒株与全球传播的猴痘毒株不同。此外，英国卫生安全局也在努力联系与该病例有过密切接触的个人，目前没有其他新的病毒感染病例。英国卫生安全局表示，将对密切接触者进行评估，并在必要时提供建议。猴痘是一种病毒性人畜共患病，由猴痘病毒感染引起。根据世界卫生组织发布的猴痘疫情统计，全球猴痘疫情确诊病例超过5万例，其中美国是猴痘疫情的重灾区。
猴痘是一种罕见的传染病，通常见于非洲中部和西部的部分地区，可通过人类旅行在主动传播中传播到其他地区。如今，欧洲、英国和美国都有确诊和疑似病例，但专家仍然不知道病毒如何、在哪里以及在社区中传播了多长时间。病毒不会轻易在人与人之间传播，但会通过与受感染的动物、人或毛巾、被褥等被污染的物质的密切接触而传播。此外，接触飞沫、体液或猴痘疮也会引起传播。猴痘的早期症状包括发热、肌肉疼痛、头痛、寒战、疲劳和淋巴结肿大。许多人在出现发烧症状后的1至5天内会出现皮疹。皮疹可能看起来像水痘或梅毒，它会发生变化，并经历不同的阶段，最终结痂和脱落。一个人在所有的痂脱落之前就具有传染性，痂下有完整的皮肤。当然，疥疮本身也可能含有传染性物质。
猴痘病例多见于男同性恋和双性恋男性，或男男性行为者。虽然病毒是否会通过性行为传播尚不得而知，但一些专家认为这是另一种传播途径。
尽管专家认为猴痘感染模式表明疾病已经在社区中传播，但目前尚不清楚不同社区之间是否存在交叉感染，以及这种关联是如何存在的。况且科学家还不知道这种病毒的宿主动物是什么。“猴痘”这个名字其实并不合适，因为它是上世纪50年代在实验室的猴子身上发现后命名的，而专家认为啮齿动物可能是宿主。美国疾病控制和预防中心表示，没有任何经过验证的安全猴痘治疗方法被批准在美国使用，但它表示，可以通过接种天花疫苗来控制疫情，天花是一种与猴痘密切相关的病毒。
基因测序是什么市场结构类型
?EN
?
国产正崛起！中国基因测序产业链图谱与市场分析
?产业资讯?火石创造?2022.07.13?1180
基因测序技术是基因检测关键技术之一，在科学研究、临床应用及其他领域得到广泛应用。经过近50年的发展，基因测序技术从第一代的Sanger技术已经发展到第四代纳米孔测序技术，其中第二代的NGS技术是市场上应用最广泛的基因测序技术，三、四代测序技术还处于发展初期。基因测序仪市场基本被跨国巨头垄断，我国基因测序生产企业主要布局测序仪配套试剂。随着国内企业不断研发与创新，一批基因测序仪自主研发产品逐渐获批上市。在市场应用方面，我国无创产前基因检测（NIPT）市场发展稳定；而随着国家政策的推动和技术的进步，肿瘤基因诊断和肿瘤早筛有望成为基因测序最有发展前景的应用市场之一。
一、基因测序定义与技术
（一） 基因测序定义
基因测序是一种新型基因检测技术，能够从血液或唾液中分析测定基因全序列，预测罹患多种疾病的可能性，个体的行为特征及行为合理。基因测序技术能锁定个人病变基因，提前预防和治疗。基因测序相关产品和技术已由实验室研究演变到临床使用，可以说基因测序技术是下一个改变世界的技术。
（二） 基因测序技术
自1975年桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）发明链终止法和1976-1977年马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明化学降解法，到1986年ABI公司首次成功实现第一代基因测序技术的商业化，再到2014年Oxford Nanopore发布纳米孔单分子测序平台，基因测序技术已经发展至第四代测序技术。
1、第一代基因测序技术（Sanger）
核心原理：由于双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）的3′位置不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA的合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分别为：ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），产生A、T、C和G4组不同长度的一系列核苷酸，然后利用凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
传统第一代基因测序技术具有准确性较高、简单和快捷等优点，但在一些方面存在限制：1）测序通量低，仅适用于小样本遗传疾病基因的鉴定，难以完成没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查；2）测序成本高、耗时长。据估算，用该法完成人类全基因组的测序，至少需用时3年，花费30亿美元。因此第一代基因检测技术大多数用于科学研究。随着科学技术的发展，高通量、低成本、自动化程度高的第二代测序技术出现。
2、第二代基因测序技术（NGS）
第二代基因测序技术，是利用一系列高通量测序技术（High-Throughput Sequencing）进行大规模的基因组DNA或RNA测序，能快速准确地获得基因组编码序列，满足极短时间内对基因组进行高分辨率检测的要求。高通量测序技术是对传统测序技术的一次革命性的改变，它又被称为下一代基因测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）。
核心原理：在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上的过程中释放出的光学信号而间接确定DNA或RNA的序列。NGS测序技术边合成边测序的原理，对比第一代基因测序技术，大大降低了测序所需时间和成本，解决了第一代技术通量低、成本高的痛点，使得基因测序实现了大规模商业化应用，是目前全球及全国市场发展主流技术。目前，单人类基因组测序成本已降至1000美元以下。
虽然NGS测序技术具有高通量、低成本和高低丰度DNA检测能力的优点，同时也存在以下缺点：1）读长短。第二代测序技术每个DNA片段的最大测序读长在400-700bp 左右，远低于第一代测序的 900-1000bp。2）测序结果处理难度大。由于第二代测序读长大幅缩短，拼接两个 DNA 片段间所需的重叠的区域也相应减小，导致测序结果的拼接难度大幅增加。另外，第二代测序由于通量高产生了大量的数据，因此给处理测序结果增加了难度。为解决这些难题，以单分子测序为标志的第三代测序技术和以纳米孔测序为代表的第四代测序技术应运而生。
3、第三代基因测序技术（单分子测序）
第三代基因测序技术（Third-generation sequencing，TGS）是指在单个细胞、单分子水平上对基因组进行测序，测序过程中不需要涉及PCR扩增，实现对每一条DNA分子的单独测序。主要包括Helico Bioscience公司的单分子测序技术和Pacific Bioscience公司的单分子实时（Singlemolecule real time，SMRT）测序技术，并以后者为代表。
区别于NGS测序技术，单分子测序技术可以通过直接读取反转录全长cDNA，有效获取高质量的单个RNA分子全部序列，进而深入研究可变剪接转录本。而且测序过程相对连续，不会因为洗去试剂或检测等步骤而暂停测序，也不用进行DNA扩增，操作便捷，测序时间短。因此单分子测序技术具有长读长、测序时间短、操作便捷等优势。目前该技术还处于科学研究阶段，随着技术的成熟，未来将广泛应用于临床。
4、第四代基因测序技术（纳米孔测序）
第四代基因测序技术，也叫做纳米孔测序技术，是基于电信号测序的技术，原理是通过电场力驱动单链核酸分子穿过纳米尺寸的蛋白孔道，由于不同的碱基通过纳米孔道时产生了不同阻断程度和阻断时间的电流信号，由此可根据电流信号识别每条核酸分子上的碱基信息，从而实现对单链核酸分子的测序。
相对于单分子测序技术，纳米孔测序技术真正实现单分子检测和电子传导检测相结合的测序方法，完全摆脱了洗脱过程、PCR扩增过程，具有超长读长、高通量、更少的测序时间、更为简单的数据分析的优点。而相对于第一代、第二代测序技术，错误率高是目前纳米孔测序的主要缺点。目前市场上的纳米孔测序平台主要是以Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION纳米孔测序仪为主，该测序仪测序读长超过150kb，测序速度快，实时数据监测，便捷携带。纳米孔测序技术目前还处于初期发展阶段，应用场景发展相对成熟的是感染病病原体检测。
表1：四代基因测序技术对比
?
来源：火石创造根据公开资料整理
二、基因测序产业链
基因测序产业链主要包括上游基因测序仪等基因测序设备和配套试剂生产制造商、中游基因测序服务商和下游应有商。
?
图1：基因测序产业链
来源：火石创造根据公开资料绘制
（一） 上游：基因测序仪等基因测序设备和配套试剂生产制造商
基因测序仪属于基因测序产业链最核心的环节之一，技术壁垒高，其装机量基本被跨国巨头垄断。目前，全球基因测序仪装机量达到2万台，其中Illumina公司的市场份额占比达80%，Thermo Fisher公司的市场份额占比达9-10%左右，Illumina公司和Thermo Fisher公司的基因测序仪装机量市场份额占比几乎接近90%。
我国已上市基因测序仪主要分为三种模式：自主研发、贴牌和与国际巨头合作研发。截至2022年3月，我国已通过NMPA有效获批上市的基因测序仪产品有15款；其中自主研发产品有9款，主要是以二代测序仪为主，华大基因与华大制造获批数量最多，合计4款。齐碳科技、真迈生物、孔确基因、迪谱诊断、今是科技等国内企业积极探索布局三代、四代测序仪和相关配套试剂。
由于基因测序仪技术壁垒高，因此国内企业大多数布局检测试剂盒等测序仪配套试剂。我国已通过NMPA有效获批上市的检测试剂盒有近300款，其中基于NGS技术的试剂盒有200多款，是目前基因测序市场高速成长的细分赛道；三代、四代配套试剂自主研发产品还处于发展初期，尚未有任何三代、四代测序器械获得医疗器械注册证件。
三份猴痘病毒最新基因测序结果公布，其中哪些信息值得关注？
关于基因测试的数据，还有检测方面的信息内容，关于基因的检测流程，病毒突变的原因，每个地方爆发的情况，都是值得关注的信息。
这些病毒的源头全部都是同一个源头，病毒的突变早就已经超乎了预期，便利的程度已经超过了科学家的预知，导致病毒蔓延的主要原因就是欧洲的两场特别大的派对，专家通过高通量鸟枪法宏基因组测序法来测试，提高了测量的精确度。
传染的源头在哪里，有没有治愈的办法，检测的结果是什么，能不能研发疫苗，什么时候可以研发出疫苗。
来自葡萄牙、比利时、美国的三个研究小组分别公布在全球多地暴发的猴痘（Monkeypox）疫情中感染者所携带病毒基因组序列的初步结果。
猴痘病毒最新基因测序结果公布，哪些信息值得关注感染猴痘的人通常在感染后7到14天开始出现症状，病情通常会持续几个星期。世界卫生组织和美国疾病控制与预防中心都宣称，“尽管大多数人能从病毒中康复，但在某些情况下，它可能是危险的，甚至可以致命。”
葡萄牙国家卫生研究所的约翰.保罗.戈麦斯（Jo o Paulo Gomes）及其同事在（https://virological.org）网站上，以论文形式公布了团队5月4日对一名葡萄牙男性患者携带的猴痘病毒的基因组测序草案（PT0001）。这也是近期全球多地暴发猴痘疫情以来，第一份猴痘病毒最新基因组的测序结果。
团队用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)从患者皮肤渗出样品中提取出猴痘病毒的DNA，使用快速条形码测序试剂盒(SQK-RBK004)，在Oxford Nanopore MinION平台上对病毒基因组进行了鸟枪法宏基因组测序。整个基因组的平均覆盖深度约为7倍。（覆盖深度，亦称测序深度，指每个碱基被测序的平均次数，即测序的数据总量与基因组大小的比值）随后，团队利用INSaFLU在线平台，将多个短基因片段（reads）映射到一个相关的参考基因组序列上(MN648051.1)，并手动检查基因组序列以验证变异位置。公布的基因组草图序列覆盖了92%的参考序列。
葡萄牙团队公布的基因进化树分析草案基于对包括52个猴痘病毒基因序列的核心比对（在137 668 bp长度的基因序列中比对了955个变异位置）根据这篇论文，基因进化树分析草案显示，分离出来的病毒与2018年和2019年从尼日利亚传播到英国、以色列和新加坡的病毒有密切关系。论文作者表示，一旦获得高深度的Illumina数据（测序还在进行中），病毒基因组序列将被进一步呈现。
现在已经得到充分研究的新冠病毒，也很难将特定的突变与病毒传播能力等方面的变化联系起来。猴痘病毒有一个庞大的基因组——大约有20万个碱基对，而冠状病毒只有3万个碱基对——目前科学家们并没有那么深入的研究。
生信分析 Minimap2+sniffles calling SVs
Minimap2 is a fast sequence mapping and alignment program that can find overlaps between long noisy reads, or map long reads or their assemblies to a reference genome optionally with detailed alignment (i.e. CIGAR). At present, it works efficiently with query sequences from a few kilobases to ~100 megabases in length at a error rate ~15%. Minimap2 outputs in the PAF or the SAM format.
pacbio reads mapping reference genome
minimap2比对必选参数
Sniffles is a structural variation caller using third generation sequencing (PacBio or Oxford Nanopore). It detects all types of SVs (10bp+) using evidence from split-read alignments, high-mismatch regions, and coverage analysis. Please note the current version of Sniffles requires sorted output from BWA-MEM (use -M and -x parameter), Minimap2 (sam file with Cigar & MD string) or NGMLR.
sniffles call SVs必选参数
obtain a multi sample vcf file from long reads using Sniffles and SURVIVOR.
Download SURVIVOR:
lack the information if a SV identified in one sample but not in the other is really absent.
obtain all calls even if they might be 0/0 in all samples.
SURVIVOR merge参数
1000表示允许合并的SV间的距离最大为1000bp;a maximum allowed distance of 1kb, as measured pairwise between breakpoints (begin1 vs begin2, end1 vs end2).
-1表示强制输出所有SV;
1表示仅输出2个工具鉴定出的同类型的SV;
-1表示输出2个工具鉴定出的所有方向的SV;
-1长度表示不过滤长度较小的SV
minimap2帮助文档： https://lh3.github.io/minimap2/minimap2.html
https://github.com/fritzsedlazeck/Sniffles
https://github.com/lh3/minimap2
SURVIVOR： https://www.jianshu.com/p/01110d85e71f
DNA测序可以采用哪些手段，并阐述各自的原理
大约可以分为一下几种测方法：
1、Sanger 测序，用链终止法和毛细管电泳，这个是第一代测序的主要方法，至今仍然在使用。
2、边合成边测序：454和Illumina测序都采用的这种方法，不过，有一些区别。454用Emusion PCR, Illumina用 Bridge PCR进行测序文库构建；454用焦磷酸发应的信号进行检测，Illumina用荧光标记进行检测；454一次性加一种dNTP，illumina一次性加4中dNTP，每次反应合成一个碱基。
3、边合成边测序：Life Tech 的SOLiD是这个方法，文库构建与454基本相同，但是测序反映采用的链接酶，每次链接一个小片段，编码方法比较复杂。
4、单分子测序： Pac BioScience目前采用的这个方法，属于第三代测序技术中比较有潜力的方法。
5、纳米孔测序： Oxford Nanopore采用的最新测序技术，是目前最为期待的第三低测序技术，还没有稳定的仪器和试剂上市。
